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近期，中科院分子细胞科学***创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）李劲松联合邹卫国团队等人在PLOS Biology上发表题为“Targeted genetic screening in mice throughhaploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development”的文章，建立了一种体内遗传筛选策略，以基于ICAHCI技术和CRISPR-Cas9文库的组合应用来鉴定参与骨发育的基因。
研究人员使用Cas9B-3-BD细胞进行ICAHCI实验，产生突变小鼠。试图通过骨骼分析来识别骨骼发育中涉及的关键基因，这些新生SC幼崽可能覆盖69个候选基因。为了测试来自Cas9B-3-BD细胞的所得SC幼崽中的突变率，研究人员分析了3个ICAHCI实验产生的总共39个SC幼崽。sgRNA插入分析表明38只幼崽携带1个sgRNA。
Sanger测序的常规基因分型分析显示其中29个在sgRNA靶向位点携带突变，其中21个携带纯合或双等位基因突变，效率为55.3％，显着高于先前报道的效率30.5％（83/272）。 TIDE或胸腺嘧啶和腺嘌呤（TA）克隆分析显示，21个纯合子或双等位基因突变小鼠中有13个携带框内突变/野生型序列，总序列少于30％。同时，TIDE结果显示12只SC幼崽携带超过2种类型的等位基因，与在Runx2被靶向时的早期观察结果一致。总之，这些结果表明，使用具有靶向sgRNA文库并组成型表达Cas9的Cas9B-3-BD细胞，可以通过ICAHCI有效地产生突变小鼠。
通过产生突变小鼠系验证Rln1和Irx5
诱变筛选对于鉴定参与发育过程的关键基因是有效的。然而，这种筛选仅在低等生物中成功。该研究通过结合雄激素单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs）和CRISPR-Cas9技术，在小鼠中开发靶向遗传筛选方法。通过卵母细胞注射携带组成型表达的Cas9的AG-haESCs和指导72个预选基因的单指导RNA（sgRNA）文库，通过骨骼筛选骨发育相关基因，制备突变半克隆（SC）小鼠库。发现了4个基因：骨骼发育所需的Zic1和Clec11a，以及之前未考虑过的Rln1和Irx5。
尽管Rln1 - / - 小鼠仅在出生时表现出较小的骨骼，但骨量减少和骨髓脂肪生成增加，Irx5 - / - 小鼠在出生后和成人阶段都显示出骨骼异常。IRX5通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）活化来促进成骨细胞生成并抑制脂肪形成。因此，AG-haESC介导的功能性诱变筛选为小鼠发育过程的遗传查询开辟了新的途径。
